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本文旨在就聚合酶链式反应（PCR）和逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）常见疑难问题进行解答。通过深入分析PCR和RT-PCR中可能出现的问题，包括实验设计、操作技巧、数据分析等方面的挑战，为科研工作者提供解决方案和建议。涵盖PCR引物设计、反应条件优化、产物纯化、特异性检测、结果解读等内容，旨在帮助读者更好地应对PCR和RT-PCR实验中的难题，提高实验效率和结果可靠性。通过本文，读者将获得更深入的PCR和RT-PCR知识，并能够更加熟练地进行实验操作，解决实验中可能遇到的各种疑难问题。
一、问题：RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。
可能原因：
1．RNA被降解
建议解决方法：
在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA；
在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA；
如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。
2．RNA中包含逆转录抑制剂
建议解决方法：
通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复。
逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，spermidine，甲酰胺和胍盐。
将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。
3．多糖同RNA共沉淀
建议解决方法：
使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
4．用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火
建议解决方法：
确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。
对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体.
确定GSP是反义序列。
5．起始RNA量不够
建议解决方法：
增加RNA量。
对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。
6．RNA模板二级结构太多
建议解决方法：
将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火.
提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。
注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。
注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。
如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。
7．引物或模板对残余的RNA模板敏感
建议解决方法：
在PCR前用RNaseH处理。
8．靶序列在分析的组织中不表达
建议解决方法：
尝试其他靶序列或组织
9．PCR没有起作用
建议解决方法：
对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。
二、问题：PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。
可能原因：
1．PCR引物设计较差
建议解决方法：
避免在引物3"端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
2．DNA含有抑制剂
建议解决方法：
诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA。
3．富含GC的模板
建议解决方法：
对于GC含量＞50％的模板，使用PCRx Enhancer Solution。
4．模板浓度太低
建议解决方法：
使用104拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。
5．镁离子浓度太低
建议解决方法：
从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR，使用3mM到5mM的镁离子浓度。
6．退火温度太高
建议解决方法：
使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。
7．引物浓度太低
建议解决方法：
最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。
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